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致瀉大腸埃希氏菌生物學特性
致瀉大腸埃希氏菌：一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌,可經(jīng)過污染食物引起人類發(fā)病。
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性短小桿菌，分類學上屬于腸桿菌科大腸埃希氏菌屬。
常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC、腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌ETEC、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌STEC(包括腸道出血性大腸埃希氏菌EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌EAEC。
致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序
操作注意事項
1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類）進行檢測時，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：取前增菌液接種腸道菌增菌肉湯后需在42±1 ℃溫度下進行培養(yǎng)，該溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)有助于抑制非腸道菌生長；
3：分離劃線用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）；
4：可疑菌落的選取，應是每個瓊脂平板上分別取10~20個（10個以下的全選）乳糖發(fā)酵和不發(fā)酵的菌落；
5：在TSI培養(yǎng)時，應將試管口松開，保持管內(nèi)有充足的氧氣，否則由于氧氣不足，斜面酸性產(chǎn)物不能氧化恢復紅色。
6：大腸埃希氏菌H抗原在傳代中容易丟失或發(fā)育不良，需在半固體上傳代3次，觀察生長，如不擴散，則表示H抗原丟失，無法做H抗原凝集試驗。
培養(yǎng)基原理解析
營養(yǎng)肉湯：
胨和牛肉浸出粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源，氯化鈉能維持均衡的滲透壓，有利于損傷細菌的復蘇。
腸道菌增菌肉湯：
蛋白胨提供蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源；酸氫二鈉和磷酸二氫鉀為緩沖劑；牛膽鹽和煌綠為選擇性抑菌劑，抑制非腸桿菌科細菌的生長。
麥康凱瓊脂（MAC）：
該培養(yǎng)基中含有牛膽鹽和結(jié)晶紫，可抑制革蘭氏陽性菌的生長，細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。
分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，培養(yǎng)基周圍有膽鹽沉淀環(huán)；不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。
伊紅美藍瓊脂（EMB）：
乳糖作為可發(fā)酵碳源，伊紅和美藍同時作為抑菌劑和指示劑，在酸性條件下，兩者結(jié)合形成黑色沉淀并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅和美藍比例相關(guān)。
分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤；不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。
三糖鐵瓊脂：
該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸使斜面先變黃，但因量少，生產(chǎn)的少量酸。因接觸空氣而氧化，加之細菌生長利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態(tài)，酸類不被氧化，仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細菌，則產(chǎn)生大量的酸，使整個培養(yǎng)基呈黃色。另外，因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀。
氰化鉀利用試驗
氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌。
結(jié)果判讀：陽性為試驗管和對照管都有生長變渾濁； 陰性為試驗管澄清不見生長，對照管生長渾濁。
靛基質(zhì)試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
結(jié)果判讀：陽性為滴加靛基質(zhì)試劑后液面立即變玫紅色； 陰性為滴加試劑后不變紅色。
尿素酶試驗
具有尿素酶的細菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色，pH8.1呈粉紅色。
結(jié)果判讀：陽性為玫紅色； 陰性為淡橙紅色-淡黃色。
生化試驗結(jié)果判讀 - 大腸埃希氏菌的生化特征
| 生化項目 | 結(jié)果 |
| 三糖鐵 | 斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)硫化氫 |
| 尿素（pH7.2） | 陰性 |
| 靛基質(zhì)試驗 | 陰性 |
| KCN | 陰性 |
取生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行PCR確認試驗
PCR確認試驗 - 致泄大腸埃希氏菌特征基因
PCR試劑盒檢測流程
致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒特點
致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒，各試劑盒檢測的對應特征性基因如下：
| 試劑盒貨號 | 檢測菌株類別 | 檢測基因組合 |
| KJD02P | EPEC STEC EHEC | uidA |
| bfpB | ||
| escV | ||
| stx2 | ||
| stx1 | ||
| KJD03P | EAEC | uidA |
| pic | ||
| aggR | ||
| astA | ||
| KJD04P | ETEC | uidA |
| sth | ||
| lt | ||
| stp | ||
| KJD05P | EIEC | uidA |
| invE |
| 形態(tài) | 組分名稱 | 規(guī)格×數(shù)量 |
| 凍干型 | 干粉試劑1 | 8管×3排 |
| 干粉試劑2（EIEC除外） | 8管×3排 | |
| 液態(tài) | 復溶液 | 1mL×1管 |
| 凍干型 | 陽性對照 | 1管 |
| 陰性對照 | 1管ATCC25922 DNA | |
| 液態(tài) | 裂解液 | 1 mL×1管 |
| 裂解液 | 1 mL×1管 | |
| loading buffer | 240 μL×1管 | |
| 說明書 | 1份 | |
血清學試驗（選做項目）
取PCR試驗確認為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進行血清學試驗。
O抗原鑒定
1）檢查培養(yǎng)物有無自凝性：在潔凈玻片上滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)蘸少許待測培養(yǎng)物，混合于生理鹽水內(nèi)，1分鐘內(nèi)無凝集現(xiàn)象，為無自凝，反之，有自凝性。
2）假定性試驗：先用大腸埃希氏菌O多價血清做玻片凝集，如果多價有凝集現(xiàn)象，再用多價所包含的單價O血清做試驗，如與某一單價O血清有凝集反應，即為假定性試驗陽性，反之為陰性。
3）確證試驗：測試培養(yǎng)物制成3號麥氏濁度菌懸液，與假定陽性的O單價血清（原效價1:160~1:320，0.5%鹽水稀釋至1:40）等量混合，放50±1 ℃，培養(yǎng)16h，觀察結(jié)果，如凝集，可證實為該O抗原。
|
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H抗原鑒定
先穿刺半固體，有動力再做H抗原鑒定。
質(zhì)量控制及疑難解析
質(zhì)量控制
1： 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數(shù)瓊脂平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養(yǎng)，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
2： 定期使用致瀉大腸埃希氏菌標準菌株或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，染菌量應控制在10~100CFU/25g，并進行記錄，次驗證實驗至少每2個月進行1次。
3：可以使用全自動或半自動的核酸提取儀提取DNA，但必須經(jīng)過驗證后使用。
4：每次PCR應使用EPEC EIEC ETEC STEC/EHEC EAEC標準菌作為陽性對照。同時使用大腸埃希氏菌ATCC25922或等效標準菌株作為陰性對照，以滅菌去離子水作為空白對照，控制PCR污染體系。
疑難解析
Q1：僅用毒力基因檢測就能對致瀉大腸埃希氏菌進行確認嗎？
按照GB4789.6-2016要求，需要先對可疑菌落進行生化鑒定，生化鑒定為大腸埃希氏菌后，再進行毒力基因的檢測，判定是何種致瀉大腸埃希氏菌。因為在腸桿菌科中，一些致病也存在相同的毒力基因，所以不能對可疑菌落直接進行毒力基因檢測來判定何種致瀉大腸埃希氏菌。
Q2：如何看待血清型與PCR結(jié)果不符的情況？
確實有這情況存在，由于血清型判定依據(jù)是菌體抗原（O抗原、H抗原、K抗原），這些抗原并不是致瀉大腸埃希氏菌發(fā)病的根本原因，而且相同血清型致瀉大腸埃希氏菌中，存在不同致病型的大腸埃希氏菌，也就是說不同致瀉大腸埃希氏菌“共享”同一個血清型，這是血清鑒定致瀉大腸埃希氏菌的不足之處，另外，隨著人類對致瀉大腸埃希氏菌致病機制的認識，并找到引起不同致病型的特征性毒力基因，因此，現(xiàn)行標準以PCR為確認方法，而血清學診斷只是選做項目。
所需培養(yǎng)基試劑
| 用途 | 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
| 樣品制備 | 022010 | 營養(yǎng)肉湯 | 250g/瓶（干粉） |
| 22010D1 | 營養(yǎng)肉湯 | 225ml/袋 | |
| 增菌 | 022160 | 腸道菌增菌肉湯 | 250g/瓶（干粉） |
| 分離 | 022140 | 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 | 250g/瓶（干粉） |
| 024076 | 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 | 90 mm×20塊/盒 | |
| 022060 | 伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基 | 250g/瓶（干粉） | |
| 024087 | 伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基 | 90 mm×20塊/盒 | |
| 生化實驗 | CP0080 | 三糖鐵斜面 | 20支/盒 |
| 075240 | 蛋白胨水 | 20支/盒 | |
| 029030 | 靛基質(zhì)試劑 | 10ml/支 | |
| 075150 | 尿素 | 20支/盒 | |
| 075330 | 氰化鉀生長試驗管 | 20支/盒 | |
| 075340 | 氰化鉀對照管 | 20支/盒 | |
| HKI005 | EasyID致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定試劑盒 | 10test/盒 | |
| 071760 | 致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定盒 | 8種×10次/盒 | |
| PCR確認 | KJD02P | EPEC-STEC-EHEC多重PCR檢測試劑盒 | 24測試/盒 |
| KJD03P | EAEC多重PCR檢測試劑盒 | 24測試/盒 | |
| KJD04P | ETEC多重PCR檢測試劑盒 | 24測試/盒 | |
| KJD05P | EIEC多重PCR檢測試劑盒 | 24測試/盒 |
