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GB4789.7-2013 副溶血性弧菌檢測及其注意事項

發(fā)布時間：2020-12-15      瀏覽次數(shù)：528    分享：

副溶血性弧菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）屬于弧菌科弧菌屬，革蘭氏陰性，無芽孢，呈弧狀、桿狀、卵圓狀等多種形態(tài)，單端鞭毛；兼性厭氧菌，嗜鹽、對葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等發(fā)酵產(chǎn)酸。

流行學(xué)特征：主要存在于溫帶地區(qū)海水、海水沉積物和魚蝦、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海國家及地區(qū)食品中毒的主要致病菌，主要污染水產(chǎn)制品或交叉污染肉制品等其他食品，人食用這些生、半生或交叉污染的海產(chǎn)品，可能導(dǎo)致急性腸胃炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等，有時甚至引起原發(fā)性敗血癥。

副溶血性弧菌的檢驗


操作注意事項
      1：樣本在收集后應(yīng)該立即被冷卻（7~10 ℃ ），然后盡快檢驗；
      2：帶貝殼類或甲殼類樣品前處理時，應(yīng)先在符合生活飲用水衛(wèi)生標準的流水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼后取樣；
      3：注意分離時所選增菌液的部位，副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌后呈均勻混濁生長，培養(yǎng)基表面容易形成菌膜，分離時，要求“液面以下1cm內(nèi)”，在這個范圍內(nèi)，應(yīng)該目標菌最多、沒有干擾的區(qū)域；
      4：一般樣品中含有多種弧菌比較常見，分離時一定要在平板上多級稀釋劃線，不要一條線劃線到底，培養(yǎng)出來發(fā)現(xiàn)沒有分開。

培養(yǎng)基原理解析

3%氯化鈉堿性蛋白胨水：

?蛋白胨提供碳源、氮源、維生素、生長因子；高含量氯化鈉和高pH值可以抑制非弧菌類細菌生長，不影響副溶血性弧菌生長。

硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：

?配方中多價蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉可刺激弧菌的生長；蔗糖是可發(fā)酵的糖類；膽酸鈉、牛膽汁粉、硫代硫酸鈉和檸檬酸鈉及較高的pH可抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群；硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵反應(yīng)作為檢測硫化氫產(chǎn)生的指示劑；溴麝香草酚藍和麝香草酚藍是pH指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

?副溶血性弧菌不發(fā)酵蔗糖，不會使培養(yǎng)基pH降低，因而在該培養(yǎng)基上為綠色菌落，創(chuàng)傷和擬態(tài)弧菌都不發(fā)酵蔗糖，需進一步確證鑒定，霍亂弧菌發(fā)酵蔗糖為黃色。

副溶血性弧菌為綠色菌落

弧菌顯色培養(yǎng)基：

?配方中蛋白胨和酵母膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；蔗糖為可發(fā)酵的糖類；抑菌劑抑制大部分非弧菌細菌，氯化鈉可維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；混合色素與副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌所對應(yīng)的酶發(fā)生特異性反應(yīng)，水解底物，釋放出顯色基團，在淡黃色平板上產(chǎn)生品紅色菌落(副溶血性弧菌)和綠-藍綠色的菌落(霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌) 。

副溶血性弧菌為品（紫）紅色菌落

3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂：

?胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、維生素、生長因子；高含量氯化鈉可以抑制非弧菌類細菌生長，不影響副溶血性弧菌生長；瓊脂為凝固劑。

氧化酶試驗：

?原理：氧化酶使細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再氧化對苯二胺試劑形成紫色復(fù)合物，產(chǎn)生顏色反應(yīng) 。

?操作：滴加1滴氧化酶試劑到一小塊潔凈濾紙上，用玻棒或接種環(huán)（鉑或塑料）挑取適量新鮮菌苔涂在試劑潤濕的紙片上；30秒內(nèi)出現(xiàn)藍紫色為陽性，延遲反應(yīng)或無顏色變化為陰性。

3％氯化鈉三糖鐵瓊脂：

?蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、維生素、礦物質(zhì)；乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類，其產(chǎn)酸時通過酚紅指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原為硫化氫，與硫酸亞鐵中的鐵鹽生成黑色硫化鐵；較高含量的氯化鈉維持弧菌均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

副溶血性弧菌在3％氯化鈉三糖鐵瓊脂上的特征

嗜鹽性試驗：

?挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。

賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基：

?具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯示出來。

?結(jié)果判讀：陽性為試驗管為綠色-藍綠色，對照管變黃色；  陰性為試驗管和對照管均變黃色，或均不變色。

賴氨酸脫羧酶試驗陽性

3%氯化鈉甘露醇發(fā)酵試驗

?絕大多數(shù)細菌利用糖（醇）類作為碳源和能源，代謝產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等），使酸堿指示劑變色來斷定。

?（指示劑為溴甲酚紫）結(jié)果判讀：陽性為變黃色；  陰性為紫色。

3%氯化鈉甘露醇發(fā)酵試驗

3%氯化鈉葡萄糖磷酸鹽胨水（VP試驗）

?某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步將丙酮酸脫羧成為乙酰甲基甲醇，后面在堿性環(huán)境下被空氣中的氧氧化成為二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等所含的胍基結(jié)合，形成紅色的化合物，即VP試驗陽性。

我妻氏血瓊脂（神奈川試驗）

?酵母膏粉、蛋白胨提供氮源、維生素、生長因子；高含量氯化鈉可以抑制非弧菌的細菌生長，不影響副溶血性弧菌生長；磷酸氫二鉀為pH緩沖劑；甘露醇為可發(fā)酵的醇；結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌，特別抑制革蘭氏陽性桿菌和糞鏈球菌；兔血紅細胞用于檢測副溶血性弧菌是否具有特定溶血素；瓊脂為凝固劑。

?陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的β溶血。

副溶血性弧菌神奈川試驗陽性

ONPG試驗

?β-半乳糖苷酶試驗是以有些細菌可產(chǎn)生β半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰硝基酚。

ONPG試驗

副溶血性弧菌的生化特性



副溶血性弧菌恒溫熒光核酸快速檢測法


質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制
       1： 實驗室過程中，每批預(yù)增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
       2： 定期使用副溶血性弧菌ATCC17802或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，污染劑量應(yīng)控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。

疑難解析

Q1： 在TCBS上生長為綠色的菌落可確定是副溶血性弧菌嗎？
      因為不發(fā)酵蔗糖能在TCBS上生長的細菌，在TCBS上都是綠色菌落，因此需做確證試驗。

Q2：使用VITEK2GN卡做副溶血性弧菌鑒定結(jié)果不穩(wěn)定怎么辦？
      建議增加3%氯化鈉三糖鐵瓊脂和嗜鹽性試驗確證，最好使用手工生化確證。

Q2：如何保存副溶血性弧菌？
      由于副溶血性弧菌在4 ℃以下不穩(wěn)定，14~49天進入活的非培養(yǎng)狀態(tài)，建議短期室溫保存用工作菌株。

所需培養(yǎng)基試


相關(guān)產(chǎn)品