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食品微生物檢驗GB4789.5-2012 志賀氏菌檢驗及注意事項

發(fā)布時間:2020-11-18      瀏覽次數(shù):20850    分享:

一、志賀氏菌的生物學特性

生物學特性:志賀氏菌屬細菌為革蘭氏陰性短桿菌,長約2~3μm,寬0.5~0.7μm,無芽胞,無莢膜,無鞭毛,有菌毛,不運動;需氧或兼性厭氧,對營養(yǎng)要求不高,在普通培養(yǎng)基(如營養(yǎng)瓊脂)上即能生長;最適生長溫度35~37℃,適宜pH為6.4~7.8。發(fā)酵糖類產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏和鮑氏志賀菌中的某些血清型偶可產(chǎn)生少量氣體)。分為4個群:A群(痢疾志賀氏菌)、B群(福氏志賀氏菌)、C群(鮑氏志賀氏菌)、D群(宋內(nèi)氏志賀氏菌)。

流行學特征:志賀氏菌產(chǎn)生強烈的內(nèi)毒素(endotoxin,ET),是一種脂多糖和脂蛋白復合物,為志賀氏菌致病的重要致病因素。A群志賀氏菌Ⅰ型能產(chǎn)生一種毒性極強的細菌外毒素稱為志賀毒素(Shigatoxin,Stx),與感染者中毒性腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒癥等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關,其毒性可表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、細胞毒性和腸毒性。在我國以福氏和宋內(nèi)志賀菌引起的菌痢最為常見。 病人和帶菌者是細菌性痢疾的傳染源,由于飲食從業(yè)人員的帶菌,可以使食品污染而造成食物型爆發(fā)。由于污水滲入供水系統(tǒng),也常造成水型的爆發(fā)。

二、志賀氏菌的檢驗

三、培養(yǎng)基原理解析

1. 志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基

?培養(yǎng)基中除胰蛋白胨、葡萄糖外,加入新生霉素作抑菌劑,并加入少量的吐溫80作增溶劑,以幫助樣品的充分分散。

?41℃厭氧培養(yǎng)有助于抑制其它雜菌生長。

2. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)

?利用膽鹽來抑制革蘭氏陽性細菌的生長;利用乳糖發(fā)酵,中性紅的顏色可把分解乳糖和不分解乳糖的細菌區(qū)分開。

?志賀氏菌呈無色菌落,半透明,光滑,濕潤,圓形,邊緣整齊或不齊。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)(MAC)

3.木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂培養(yǎng)基

?脫氧膽酸鈉可以抑制革蘭氏陽性細菌和部分大腸桿菌,多數(shù)志賀氏菌不能發(fā)酵木糖,木糖的添加可將志賀氏菌與其它菌株區(qū)別開來,因此,志賀氏菌在XLD平板上呈現(xiàn)無色菌落,但少數(shù)發(fā)酵木糖的志賀氏菌在此平板上會被漏檢,XLD平板對宋內(nèi)志賀氏菌亦有輕度抑制作用。

?志賀氏菌通常呈粉紅色至無色,半透明,光滑,濕潤,圓形,邊緣整齊或不齊菌落。

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂菌落特征

4.志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

?利用非志賀氏菌的特異性的酶,使其與酶底物結(jié)合形成不同顏色的菌落,而生化特性反應不活躍的志賀氏菌經(jīng)22~28h培養(yǎng)后,則形成易于識別的白色-粉紅色(與培養(yǎng)基顏色相近)的菌落。

?志賀氏菌呈白色/清晰的菌落,大小約為1~3mm,周圍培養(yǎng)基變紅。

5.三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基

?該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1,只能利用葡萄糖的細菌,葡萄糖被分解產(chǎn)酸使斜面先變黃,但因量少,生產(chǎn)的少量酸。因接觸空氣而氧化,加之細菌生長利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態(tài),酸類不被氧化,仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細菌,則產(chǎn)生大量的酸,使整個培養(yǎng)基呈黃色。另外,因某些細菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氫,硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

三糖鐵

6.靛基質(zhì)試驗

?某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

?結(jié)果判讀:陽性為滴加靛基質(zhì)試劑后液面立即變玫紅色; 陰性為滴加試劑后不變紅色。

靛基質(zhì)試驗

7.尿素酶試驗

?具有尿素酶的細菌分解培養(yǎng)基中的尿素,產(chǎn)生大量的氨,使培養(yǎng)呈堿性,酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色,pH8.1呈粉紅色。

?結(jié)果判讀:陽性為玫紅色; 陰性為淡橙紅色-淡黃色。

尿素酶試驗

8.賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗

?具有氨基酸脫羧酶的細菌,能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培養(yǎng)基變堿,使指示劑顯示出來。

?結(jié)果判讀:陽性為試驗管為綠色-藍綠色,對照管變黃色; 陰性為試驗管和對照管均變黃色,或均不變色。

賴氨酸脫羧酶試驗陽性

9.糖(醇)發(fā)酵試驗

?絕大多數(shù)細菌都能利用糖(醇)類作為碳源和能源,但是它們在分解糖(醇)的能力上有很大的差異,有些細菌能分解某種糖(醇)并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。

?(指示劑為溴甲酚紫)結(jié)果判讀:陽性為變黃色; 陰性為紫色。

甘露醇發(fā)酵試驗

10.β-半乳糖苷酶

?某些細菌可產(chǎn)生b-半乳糖苷酶,能分解鄰硝基酚-b半乳糖苷(ONPG),生成黃色的鄰硝基酚。

?結(jié)果判讀:陽性為黃色; 陰性為不變色-淡黃色。

ONPG生化管

11.  葡萄糖銨試驗

?鑒別細菌利用銨鹽作為唯一氮源并分解葡萄糖的試驗。溴麝香草酚藍是指示劑,產(chǎn)酸時培養(yǎng)基由綠色變黃色。

?結(jié)果判讀:陽性為黃色; 陰性為綠色。

葡糖糖銨利用試驗

12.  西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

?細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源,能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養(yǎng)基上生長,分解檸檬酸鹽生成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變堿性。

?結(jié)果判讀:陽性為藍綠-藍色; 陰性為綠色。

西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基試驗

13.  粘液酸鹽試驗

?某些細菌能利用粘液酸鹽,分解產(chǎn)酸,使培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍變黃色。

?結(jié)果判讀:陽性為黃色; 陰性為綠色-藍綠色。

粘液酸鹽試驗

四、志賀氏菌的生化鑒定

生化反應

A群:痢疾志賀氏菌

B群:福氏志賀氏菌

C群:鮑氏志賀氏菌

D群:宋內(nèi)氏志賀氏菌

?-半乳糖苷酶

-a

-a

尿素

賴氨酸脫羧酶

鳥氨酸脫羧酶

-b

水楊苷

七葉苷

靛基質(zhì)

-/+

(+)

-/+

甘露醇

+c

棉子糖

甘油

(+)

(+)

d

注:+表示陽性;-表示陰性;-/+表示多數(shù)陰性;+/-表示多數(shù)陽性;(+)表示遲緩陽性;d表示有不同生化型。

a痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。

b鮑氏13型為鳥氨酸陽性。

c福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。

?附加生化鑒定

?由于某些不活潑的大腸埃希氏菌(anaerogenic E.coil.)、A-D(堿性-異型Alkalescens-D isparbiotypes)菌的部分生化特征與志賀氏菌相似,并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集。需要進一步做葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養(yǎng)24 h~48 h)。

生化反應

A群:痢疾志賀氏菌

B群:福氏志賀氏菌

C群:鮑氏志賀氏菌

D群:宋內(nèi)氏志賀氏菌

大腸埃希氏菌

A-D菌

 

葡萄糖銨

西蒙氏檸檬酸鹽

d

d

粘液酸鹽

d

d

注1:+表示陽性;-表示陰性;d表示有不同生化型。

注2:在葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗三項反應中志賀氏菌一般為陰性,而不活潑的大腸埃希氏菌、A-D(堿性-異型)菌至少有一項反應為陽性。

 

五、志賀氏菌的血清診斷

?志賀氏菌屬沒有動力,所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體(O)抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。

?一般采用1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原

?在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域,挑取一環(huán)待測菌,各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部,在其中一個區(qū)域下部加1滴抗血清,在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水,作為對照。

?再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min,并對著黑色背景進行觀察,如果抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒,而且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象,那么凝集反應為陽性。

?如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征,而其血清學試驗為陰性的話,可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液,100℃煮沸15 min~60 min去除K抗原后再檢查。

六、所需培養(yǎng)基試劑

用途

貨號

名稱

規(guī)格

增菌

023141

志賀氏菌增菌肉湯

瓶(干粉)250g

SR0380

志賀氏菌增菌肉湯配套試劑(新生霉素)

盒(西林瓶)10支/盒

CP0730

志賀氏菌增菌肉湯(需加配套試劑)

盒(袋裝)225 mL×10袋

平板分離

029999

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

瓶(干粉)250g

029999P1

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

瓶(顆粒)250g

CP0180

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

盒(平板)90 mm×20

022144

麥康凱瓊脂

瓶(干粉)250g

024076

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板

盒(平板)90 mm×20

CRM011

志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

1000mL

CRM011A

志賀氏菌顯色瓊脂平板

盒(平板)90 mm×20

生化鑒定

022080

三糖鐵瓊脂(TSI)

瓶(干粉)250g

CP0080

三糖鐵斜面

盒(管裝)20支

026050

半固體瓊脂

瓶(干粉)250g

075350A

半固體瓊脂

盒(管裝)20支

CP0150

營養(yǎng)瓊脂

盒(管裝)20支

024089

營養(yǎng)瓊脂平板

盒(平板)90 mm×20

022020

營養(yǎng)瓊脂

瓶(干粉)250g

022020P1

營養(yǎng)瓊脂(NA)

瓶(顆粒)250g

023090

尿素瓊脂培養(yǎng)基基礎

瓶(干粉)100g

029100

40%無菌尿素溶液

盒(西林瓶)10支/盒

生化鑒定

075150

尿素(凍干)

盒(西林瓶)10支/盒

075280

賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

盒(西林瓶)20支/盒

075270

L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

盒(西林瓶)20支/盒

075290

氨基酸脫羧酶對照培養(yǎng)基

盒(西林瓶)20支/盒

029110

無菌石蠟油

10 mL×1支

075180

β-半乳糖苷ONPG

盒(西林瓶)20支/盒

075140

水楊素(水楊苷)

盒(西林瓶)20支/盒

075160

七葉靈(七葉苷)

盒(西林瓶)20支/盒

075040

甘露醇

盒(西林瓶)20支/盒

075230

D-棉籽糖

盒(西林瓶)20支/盒

生化鑒定

022110

蛋白胨水(靛基質(zhì)培養(yǎng)基,色氨酸肉湯)

瓶(干粉)100g

075240

蛋白胨水(靛基質(zhì)培養(yǎng)基,色氨酸肉湯)

盒(西林瓶)20支/盒

029230

靛基質(zhì)試劑

10 mL×1支

075840

甘油發(fā)酵管

盒(西林瓶)20支/盒

075260

葡萄糖銨

盒(西林瓶)20支/盒

023150

葡萄糖銨培養(yǎng)基

瓶(干粉)250g

075200

西蒙氏檸檬酸鹽

盒(西林瓶)20支/盒

022120

西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

瓶(干粉)250g

075521

粘液酸鹽測試肉湯

盒(西林瓶)20支/盒

075522

粘液酸鹽質(zhì)控肉湯

盒(西林瓶)20支/盒