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更新 | GB 4789.9-2014 空腸彎曲菌檢驗及注意事項

發(fā)布時間：2024-05-27      瀏覽次數(shù)：957    分享：

空腸彎曲菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：彎曲菌屬是一類耐熱微需氧菌，革蘭氏染色陰性。彎曲菌體彎曲如小逗點狀，菌體兩端相接時呈“S”形、螺旋狀或海鷗展翅狀，菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，無芽孢。彎曲菌包括17個種和8個亞種，引起人類感染致病菌的彎曲菌中80%~90%都是空腸彎曲菌。

流行學(xué)特征：空腸彎曲菌廣泛分布于自然界中，是人畜共患致病菌微生物，人類感染主要是以食用生的、未徹底加熱的禽肉和消毒不充分的牛奶為主，衛(wèi)生較差的地區(qū)則以水源性傳播多見。臨床表現(xiàn)為急性或自限性腸炎，癥狀和普通腸炎類似，20%以上患者會出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)或病程延長現(xiàn)象，嚴重者會并發(fā)格林-巴利綜合征。

空腸彎曲菌的檢驗

 

操作注意事項

1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類、貝類）進行檢測時，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：檢測含乳制品時，均質(zhì)后后應(yīng)檢測pH值。如有必要，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)整pH值到7.5±0.2；
3：馬尿酸鈉水解實驗和吲哚乙酸酯水解實驗中，為保證實驗結(jié)果的準確性，需要挑取培養(yǎng)狀態(tài)良好的新鮮菌落，菌量應(yīng)該足夠大；
4：馬尿酸鈉水解實驗中，加入茚三酮溶液后，不要震蕩，36℃±1℃水浴或培養(yǎng)箱溫浴10min后及時觀察結(jié)果，不可放置時間太長，以免干擾結(jié)果判讀；

培養(yǎng)基原理解析

1、Bolton肉湯

? 配方中乳白蛋白水解物、動物組織酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各種維生素；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉和偏亞硫酸氫鈉能中和培養(yǎng)基的有毒物質(zhì)，也能增強培養(yǎng)基的空氣耐受力；a-酮戊二酸提供生長因子，促進空腸彎曲菌的生長；碳酸鈉提供空腸彎曲菌最有利的酸堿環(huán)境；頭孢派酮和多粘菌素B抑制革蘭氏陰性菌；萬古霉素和三甲氧芐胺嘧啶抑制革蘭氏陽性菌；兩性霉素B抑制酵母和真菌的生長。

2、改良CCD瓊脂
? 配方中肉浸液、動物組織酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源、維生素、生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改變表面張力的作用；去氧膽酸鈉為選擇性抑菌劑；頭孢哌酮可抑制普通腸道菌生長、兩性霉素B 抑制酵母和真菌生長、利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌。硫酸亞鐵和丙酮酸鈉有利于空腸彎曲菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。
? mCCD瓊脂平板上的可疑空彎菌落通常為淡灰色，有金屬光澤、潮濕扁平，呈擴散生長的傾向。

空腸彎曲菌為灰色菌落

3、Skirrow瓊脂
? 配方中蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏提供碳、氮源、維生素、生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸亞鐵有利于彎曲菌的生長。頭孢呱酮可抑制革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽性菌、兩性霉素B 抑制真菌生長、利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌。瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

空腸彎曲菌為灰色濕潤單菌落或沿接種線擴散生長

4、哥倫比亞血瓊脂
? 配方中動物組織酶解物、淀粉提供碳氮源、維生素和生長因子；羊血是細菌生長繁殖的良好營養(yǎng)物質(zhì)。在45～50℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血液可以保存血液中某些不耐熱的生長因子，同時血球不被破壞。慶大霉素能抑制腸桿菌科和銅綠假單胞菌的生長。

空腸彎曲菌為灰色濕潤沿接種線擴散生長菌落

 

5、氧化酶試驗
? 原理：氧化酶使細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再氧化對苯二胺試劑形成紫色復(fù)合物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
? 操作：滴加1滴氧化酶試劑到一小塊潔凈濾紙上，用玻棒或接種環(huán)（鉑或塑料）挑取適量新鮮菌苔涂在試劑潤濕的紙片上；30秒內(nèi)出現(xiàn)藍紫色為陽性，延遲反應(yīng)或無顏色變化為陰性。

 

6、過氧化氫酶試驗
? 具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。
? 操作：挑取一環(huán)菌落培養(yǎng)物，加到在干凈顯微鏡玻片上的一滴3％過氧化氫溶液中，如果在30秒內(nèi)出現(xiàn)氣泡則判定結(jié)果為陽性。

過氧化氫酶陽性

 

7、馬尿酸鈉水解試驗
? 原理：細菌具有馬尿酸鈉水解酶，可將馬尿酸鈉水解為甘氨酸和苯甲酸，甘氨酸可與茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物。
? 操作：挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，加到盛有0.4mL 1％的馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液，注意不要帶入培養(yǎng)基瓊脂?；旌暇鶆蚝笤?7℃水浴中溫育2 h或36℃培養(yǎng)箱中溫育4 h。輕輕地在馬尿酸鹽溶液的頂部加入0.2mL茚三酮溶液，不要振蕩，在37℃水浴或36℃培養(yǎng)箱中溫育10 min后判讀結(jié)果。若出現(xiàn)黑紫色則為陽性；若出現(xiàn)淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。

馬尿酸鈉水解試驗陽性

8、吲哚乙酸酯水解試驗
? 挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，加到羥基吲哚醋酸鹽紙片上面，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，則在5～10min內(nèi)出現(xiàn)深藍色；若沒有顏色變化則表示水解反應(yīng)沒有發(fā)生。

吲哚乙酸水解試驗陽性

空腸彎曲菌的生化特性


質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制

1、實驗室過程中，每批預(yù)增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

2、定期使用空腸彎曲菌ATCC33291或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，污染劑量應(yīng)控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次次。

疑難解析

問：空腸彎曲菌在mCCDA瓊脂的形態(tài)是否僅限于正文所述？還有無其他形態(tài)？
答：空腸彎曲菌在mCCDA瓊脂平板上的形態(tài)與在Skirrow瓊脂平板上相似，但也有可能出現(xiàn)2種形態(tài)，一種為有光澤、潮濕、扁平菌落，呈擴散生長的傾向，另一種為分散凸起、有金屬光澤的單個菌落，直徑約為1~2mm。

問：在前增菌或選擇性增菌結(jié)束后，肉湯未見微生物生長，是否可以終止實驗?
答：不可以，因為肉湯可見的細菌濃度為107CFU/ml，在此濃度一下，肉眼不能發(fā)現(xiàn)微生物生長，但實際溶液中有微生物生長。 

所需培養(yǎng)基試劑

用途貨號名稱規(guī)格
增菌C-43圓底立式培養(yǎng)袋10個/包
C-22.5L 微需氧產(chǎn)氣劑10袋/包
280250.1% 蛋白胨水250g
27380Bolton肉湯基礎(chǔ)250g
SR0340Bolton肉湯配套試劑10支/盒
CP0570ABolton肉湯（含羊血，抗生素）100mL×6瓶
CP0571Bolton肉湯（含羊血，抗生素）225mL×6瓶
CP0211Bolton肉湯（含羊血，抗生素）10mL×20支
篩選及純化27382改良CCD瓊脂基礎(chǔ)250g/瓶
SR0320改良CCD瓊脂基礎(chǔ)配套試劑10支/盒
CP0580改良CCD瓊脂平板90mm×20/盒
27385Skirrow瓊脂基礎(chǔ)250g/瓶
SR0330Skirrow瓊脂配套試劑10支/盒
CP0590Skirrow血瓊脂平板90mm×20/盒
29010革蘭氏染色液10mL×4瓶
29170氧化酶試紙10片/盒
24061哥倫比亞血瓊脂250g/瓶
CP0160哥倫比亞血瓊脂平板90mm×20/盒
生化鑒定291613%過氧化氫溶液2mL×10支
75770馬尿酸鹽20支/盒
29231茚三酮試劑10mL/瓶
SR0360吲哚乙酸酯紙片20片/盒

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GB4789.9

 

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