分離純化后才能獲得單一菌株，單一菌株進(jìn)行菌種保藏才有意義，防止菌種交叉污染和變異，這也是菌種保存的基本原則。

1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎？

答：可以。對于霉菌等真菌需培養(yǎng)7天進(jìn)行保存，而酵母菌需培養(yǎng)三天將孢子洗脫下來進(jìn)行保存，保存管中的小瓷珠可以作為介質(zhì)來吸附孢子和菌絲，相當(dāng)于砂土保存法中砂土作為載體起到的作用。

2、所有的菌都能保存嗎？如果不是的話，什么樣的菌可以保存？什么樣的菌不可以保存？

答：可以。菌種保存的原理是預(yù)防或減緩DNA復(fù)制時自發(fā)突變導(dǎo)致菌種退化，因此要創(chuàng)造代謝不活潑的狀態(tài)，而菌種保存時使菌種進(jìn)入休眠態(tài)（孢子、芽孢)，并創(chuàng)造干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)的環(huán)境，創(chuàng)造的環(huán)境越接近此狀態(tài)，所保存的菌種的時間就越長，所以從原理上講，所有菌種都可用這種方法保存，但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血桿菌、腦膜炎萘瑟氏菌）等特殊細(xì)菌保存時，需-80℃或更低溫度保存，才可以做到更長期的保存。

3、能用菌種保存管永/久保存菌株嗎？

答：溫度越低，保藏效果越好。從目前的試驗數(shù)據(jù)及實際保存效果來看，-20℃可保存1-5年，-80℃或液氮中可保存5-10年，不同菌種及不同的保存溫度保存時間會有所不同（例如：大腸、沙門等常規(guī)細(xì)菌-20℃我們目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進(jìn)行生化特征的鑒定，確定菌株無變異。

4、菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出來活化的話屬于第幾代？

答：保存的是第三代復(fù)活出來后，如果采用平板或肉湯活化相當(dāng)于轉(zhuǎn)接了一代，就是第四代了，如果還在瓷珠里的話就還是原來的代數(shù)。如果是保存在斜面上，這一支斜面一直就是第三代，如果轉(zhuǎn)接到另一支斜面就是第四代了。傳代原則，菌株活化復(fù)蘇不論以任何形式繁殖了一次就算是傳了一代。但如果僅是物理位置的轉(zhuǎn)移沒有繁殖就不是傳代，需要注意。

5、剛買回來的陽性菌株是第0代嗎？

答：一般菌株你買回來的時候上面都會寫明第幾代，常規(guī)來說都是第0代的。像購買的ATCC或CICC的凍干粉都是標(biāo)記為0代的。

6、菌株傳代保存到瓷珠里一定要挑單菌落嗎？

答：不一定非挑單菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是說從同一個菌落純化出來的，以保證它們的特性完全一致。原則是盡量多挑，寧多勿少。

7、怎樣延長菌株的保存時間呢？

答：大量的實驗證明菌株在低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)的條件下保存效果是最/好的，越接近這種保存條件，菌株的保存時間越長。

8、怎樣純化菌株？

答：純化就是從TSA上或別的非選擇性平板上轉(zhuǎn)接一次，這就相當(dāng)于純化了。

9、我們保存的一代菌株是不是要重新傳代保存呢，認(rèn)證老師會不會認(rèn)為這是個錯誤？

答：應(yīng)該不會，認(rèn)證老師不會提出這種問題的，不過最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些，使用時工作菌株最好使用第三代菌株，一代菌株可作為長期保存用。

10、為何要將第三代作為工作菌株？

答：多傳代幾次后菌株的活力會明顯提高，但最多傳代到第五代后就不能用了，因為第五代后菌株雖然不會完全變異，但變異率會明顯增加，因此選用第三代作為工作菌株是比較合適的，若使用第一、第二代菌株活力沒有那么強(qiáng)。

11、用瓷珠管反復(fù)上下?lián)u勻，有泡沫不容易吸出來，怎么辦？

答：不必特別劇烈大尺度的搖動瓷珠管，稍微上下晃動就可以；如果確實有泡沫的話可以靜置一會，讓菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。

12、TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里嗎？

答：2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和綠膿桿菌要放到室溫20-25℃保存，否則會很快死亡。

13、如果TSA斜面放在冷凍里面，會有什么影響？

答：瓊脂冷凍后性狀會發(fā)生改變，會變得很軟，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，所以不建議冷凍；如果要冷凍的話就采用甘油保存法或瓷珠保存法。

14、用瓷珠管保存產(chǎn)氣莢膜梭菌老是保存不好！做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厭氧袋里面再放到-20℃么？

答：如果冷凍保存最好放在厭氧袋里再-20°保存，保存效果還可以；或者可以采用庖肉培養(yǎng)基保存，它是一種液體培養(yǎng)基，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接進(jìn)去然后2-8℃保存，可以保存一年沒有問題，在厭氧環(huán)境下保存效果最好。

15、菌種保藏時為什么要進(jìn)行分離純化？

答：分離純化后才能獲得單一菌株，單一菌株進(jìn)行菌種保藏才有意義，防止菌種交叉污染和變異，這也是菌種保存的基本原則。

16、菌種保存管對于平板來說，對挑選菌落個數(shù)有要求嗎？還是將整個平板的菌落全部刮入管中？

答：對于要保存的細(xì)菌一般是要進(jìn)行2-3次的純化，要保證一個平板上的菌是由單一菌落傳代而來的，所以在細(xì)菌保存的過程中，為了保證制備的菌懸液可以達(dá)到3-4MCF，是可以將整個平板的的細(xì)菌全部刮到管中的，如果平板長的比較滿一般半個平板就夠用，具體用量也根據(jù)菌種的不同有所差異，如霉菌、酵母菌在保存時，不適合用濁度法。

17、對于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的純菌，是否也可以用咱們的菌種保存管？如果可以的話，怎么操作？

答：是可以用的，如果液體培養(yǎng)基能保證是純菌的話，可以直接離心，棄掉上清，然后把保存管中液體吸進(jìn)去充分混勻，然后再轉(zhuǎn)移到菌種保存管中，整個過程要注意無菌操作。不過，一般菌種保存管最好選擇平板菌落進(jìn)行保存，因為液體培養(yǎng)基中有雜菌是不易觀察出來的。

18、為什么在菌種保存時，要上下顛倒？為什么不能旋搖？

答：上下顛倒，可使菌懸液充分混勻，菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上，旋搖不利于菌懸液充分混勻，反而會使菌株全部沉淀于管底。

19、為什么在使用時要將管內(nèi)的液體盡可能多的吸出？

答：吸出液體可避免反復(fù)凍融形成的冰晶對菌株的損傷，加快復(fù)蘇的過程，因此，要盡可能的將與菌種混勻后的保存液吸凈。而常用的甘油法，在復(fù)蘇的過程中需用水浴鍋快速溶解，在此過程中，對菌株傷害較大。

20、在使用后，菌種保存管的保存環(huán)境？需要-80℃冰箱嗎？

答：大部分菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法，因此，使用后，需放置低溫環(huán)境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且溫度越低，保存效果越好。用戶需根據(jù)菌種的保存要求選擇具體保存溫度。

21、為什么說，如果有條件的話，菌種保存管最好置于-80冰箱或液氮中？

答：因為，貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，可極大降低冰晶形成對細(xì)菌的傷害，同時可為被保存的菌種創(chuàng)造更低的代謝環(huán)境，從而延長細(xì)菌保存的時間。

22、菌株保存是-70℃還是-80℃有具體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定么？

答：其實是有標(biāo)準(zhǔn)的，《SN/T2632-2010微生物菌株常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程》是關(guān)于菌株保藏的一個標(biāo)準(zhǔn)，大家可以學(xué)習(xí)一下，各個保存方式都有介紹，但是瓷珠是比較新興的保存方式暫時里面還沒有收錄。

23、為什么在取用菌株時，操作過程要求快速？

答：菌種保存復(fù)蘇的原則，要求慢凍快融，之所以要求快速，是因為在菌種復(fù)蘇的過程中，長時間的溶解過程會對所保存的菌種造成損傷，而我們經(jīng)過改良的保存方法最/大程度的避免復(fù)蘇所造成的影響，但我們還是建議遵循菌種的保存復(fù)蘇原則，保證所復(fù)蘇菌種的復(fù)蘇率。

24、將菌株反復(fù)凍存，到底對菌株有什么影響？

答：低溫會使菌株細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷。細(xì)胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。如果放到低溫（不是一般冰箱）進(jìn)行冷凍時，會產(chǎn)生冰晶，冰晶呈針狀，極易導(dǎo)致細(xì)菌的嚴(yán)重?fù)p傷。用電鏡觀察，可見細(xì)菌的核膜上有大量針尖樣小孔，當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會變大，故反復(fù)凍存，會對菌株造成極大損傷。

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