GB 4789.2-2022標(biāo)準(zhǔn)變更初探

菌落總數(shù)測定是食品微生物檢驗中應(yīng)用得最為廣泛一個檢測方法，其國標(biāo)方法文本屢經(jīng)修訂，不斷完善。歷經(jīng)了1984版、1994版、2003版、2008版、2010版、2016版到今天的2022版，在38年間已經(jīng)陸續(xù)修訂發(fā)布了7個版本，平均5年修訂一次，這應(yīng)該是GB4789系列里之最了，恐怕在國家標(biāo)準(zhǔn)中也不多見，足見其重要性。

即將實施——：
      《GB 4789.2-2022 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》于2022年6月30日發(fā)布，將于2022年12月30日起正式實施。在這半年的新舊版過渡期內(nèi)，廣大食品檢測機構(gòu)應(yīng)組織技術(shù)人員深入學(xué)習(xí)和理解新舊標(biāo)準(zhǔn)文本的差異，并進行必要技術(shù)性驗證。以下就是筆者對新版標(biāo)準(zhǔn)文本變更的一些粗淺認識，希望達到拋磚引玉的效果。

作為一個應(yīng)用廣泛、檢測頻次較高的方法標(biāo)準(zhǔn)，其細微的變化都會引起業(yè)界的關(guān)注，尤其是某些重大的變化甚至還可能會帶來一系列的連鎖效應(yīng)。總的來說，新版標(biāo)準(zhǔn)再次引入了測試紙片法，這應(yīng)該是一個突破，預(yù)示著今后國標(biāo)方法體系對于傳統(tǒng)方法的可能會有更多的補充，此外還增加了菌落計數(shù)范例，完善了一些文字方面的細節(jié)，進一步增強了方法標(biāo)準(zhǔn)的可操作性、實用性、靈活性。

設(shè)備材料

將3.3中原來的“恒溫水浴箱”修改為“恒溫裝置”，擴大了適用范圍，便于實驗室靈活采用各種適宜的保溫方式，并將溫度范圍由“46℃±1℃”改為“48℃±2℃”，以呼應(yīng)后文中設(shè)備和溫度范圍的變化。在實際應(yīng)用中，很多實驗室在恒溫水浴箱之外可能還采用了專用的培養(yǎng)基液化保溫裝置等設(shè)備，新標(biāo)準(zhǔn)修訂之后賦予了這些補充手段的合規(guī)性。無論采用怎樣的等效手段，實驗室一定要重視保溫裝置的溫度校準(zhǔn)和日常監(jiān)控、維護保養(yǎng)。

培養(yǎng)基和試劑

（一）增加了“4.2菌落總數(shù)測試紙片：應(yīng)符合GB4789.28中平板計數(shù)培養(yǎng)基質(zhì)量控制要求，且主要營養(yǎng)成分與平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配方一致”。

      1、相較于傳統(tǒng)的平板傾注法，測試紙片法具有易用、便捷、高效、不具熱損害的優(yōu)點，測試紙片法首次出現(xiàn)在2008版并作為第二法，但僅在兩年后即在2010版中被刪除。而類似的《SN/T 1897-2007 食品中菌落總數(shù)的測定 Petrifilm?測試片法》比2008版更早發(fā)布實施，但也已于2015年被廢止，給出的理由是“方法涉及試劑盒，未經(jīng)評估”。[1]目前涉及紙片法的現(xiàn)行有效的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數(shù) 方法一》以及即將實施的《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數(shù) 方法二》，明確了測試紙片的商品化試劑盒性質(zhì)。然而，這次修訂的文本并未將測試紙片法作為第二法來呈現(xiàn)，可能也還是出于審慎的態(tài)度。

      2、測試紙片“主要營養(yǎng)成分與平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配方一致”即指符合附錄A.1的PCA主要成分，包括：胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖，至于其他成分如顯色劑、冷凝膠等各品牌配方可能會有差異。實驗室應(yīng)要求廠家提供配方證明文件，并作比較確認。

      3、至于測試片的技術(shù)性驗收，如果參照現(xiàn)行的GB 4789.28可能不具可操作性，因為需要進行劃線測定生長率，鑒于測試紙片的物理性狀可能不太適合，只能等待新版的GB 4789.28正式發(fā)布。目前可供參考的是《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數(shù) 方法一》和《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測方法 菌落總數(shù) 方法二》附錄中的評價方法。該附錄參照《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測試劑盒評價方法》要求，評價了特定品牌測試紙片與國標(biāo)法的線性關(guān)系及準(zhǔn)確度、耐變性、批間差異，并進行了實驗室間驗證試驗。程序比較復(fù)雜，工作量較大，對于一般的實驗室可能較難完成。

（二）將老版的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均加上了“無菌”作為定語修飾，與后文6.1中的描述呼應(yīng)，也進一步強調(diào)了無菌操作。

（三）測試紙片的相關(guān)知識[2]

      1、檢測原理：測試片主要由培養(yǎng)基、冷水可凝膠、顯色劑組成，菌落總數(shù)大多數(shù)用的顯色劑是TTC。細菌在測試片上生長時，細胞代謝產(chǎn)物與濃度極低的指示劑TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將指示劑還原成紅色產(chǎn)物，從而使細菌著色。所以，大多數(shù)測試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)。

      2、適用范圍：由于操作簡單，被廣泛使用于加工過程菌落總數(shù)快速測定。適用于大部分食品及環(huán)境涂抹樣本，適用范圍較廣泛。

      3、常見品牌：目前市場上的主流測試片形式有測試片和測試板，測試片又分冷水可溶性凝膠的和無紡布兩種，測試板多為板上加無紡布的形式。常見的進口品牌包括美國3M、美國Charm、日本DNP、德國默克等，國產(chǎn)品牌有陸橋、環(huán)凱、美正等。

      4、常見的問題
      ① 出現(xiàn)菌落蔓延、水化現(xiàn)象。冰淇淋、糕點、加工肉制品、調(diào)味料等食品中的芽孢桿菌易發(fā)生液化現(xiàn)象，可以通過減少堆疊數(shù)量或者進一步稀釋來解決。
      ② TTC作為指示劑是否會抑制菌落的生長？測試片添加的極低濃度TTC不足以對多數(shù)常見微生物造成抑制，此外多數(shù)測試片的工藝采取的是分層涂布，TTC位于最上層，因此只有當(dāng)菌落凸出之后才能接觸到低濃度TTC。
      ③ 顏色較深的樣品可能會有干擾，部分辛辣調(diào)味料會有干擾抑制，可選擇合適的稀釋倍數(shù)或帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋進行樣品處理，具體依據(jù)各廠家的技術(shù)聲明來執(zhí)行。
      ④ 開封后測試片保存方式。密封夾密封后，常溫/冷藏、避光、干燥保存，并于1個月內(nèi)使用完。如果從冰箱中取出后要常溫放置一段時間再打開使用以防止冷凝水的產(chǎn)生。

檢驗程序

主要是對“圖1 菌落總數(shù)的檢驗程序”增加了一些注釋性文字：
      1、將“2個~3個適宜稀釋度”改為“1個~3個適宜稀釋度”，與后文“6.1.5”的改動保持一致。
      2、“培養(yǎng)”框之下的箭頭旁增加“36℃±1℃，48h±2h”和“水產(chǎn)品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述。

操作步驟

（一）樣品的稀釋

      1、6.1.1和6.1.2中提及的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均增加了“無菌”作為修飾定語。

      2、6.1.2 中增加了“或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min”明確了液體樣品允許使用均質(zhì)器進行均質(zhì)，這是符合現(xiàn)實需要的改變。此外，還增加了“如果結(jié)果單位為g的時候按6.11取樣方式前處理”的描述，解決了冰塊、冰淇淋等固體樣本融化后取樣方式的困擾。

      3、6.1.3 中將“振搖試管或用1支無菌移液管反復(fù)吹打使其混合均勻”改為“在振蕩器上振蕩混勻”。

      4、6.1.5中將“2~3個適宜稀釋度”改為“1~3個適宜稀釋度”，更加靈活，切合實際情況。允許只做1個梯度，減少了檢測的工作量，但對檢驗經(jīng)驗和操作水平要求更高了，如果僅有的一個梯度出現(xiàn)多不可計或平行不好的情況則難以保證檢測結(jié)果的可靠性，此外如果出現(xiàn)樣本中抑菌物質(zhì)造成的計數(shù)結(jié)果與稀釋度不成比例現(xiàn)象，也不容易發(fā)現(xiàn)，因此建議盡量采用2~3個稀釋度以規(guī)避可能的風(fēng)險。

      5、從此處開始，文中所有的“平皿”均替換為“培養(yǎng)皿”，更加規(guī)范和準(zhǔn)確，但其他同時期發(fā)布的新標(biāo)準(zhǔn)中并未執(zhí)行這一術(shù)語的統(tǒng)一。

      6、6.1.6中的平板計數(shù)瓊脂溫度由“46℃”改為“46℃~50℃”，相應(yīng)地，括弧內(nèi)恒溫水浴鍋及其溫度均改為“恒溫裝置”和“48℃±2℃”。美國FDA BAM規(guī)定為45℃±1℃，ISO 4833-1：2013為44℃~47℃（將改為47℃~50℃）。在實際工作中，尤其是冬季氣溫較低的時候，考慮到傾注的時間，適當(dāng)提高瓊脂的溫度使得更具可操作性。然而過高的溫度可能會對某些細菌造成損傷，影響結(jié)果，因此實驗室務(wù)必把握好尺度。

（二）培養(yǎng)

      1、6.2.1這里的仍然沿用的“平板”而非之前的“培養(yǎng)皿”，是筆誤還是修訂者認為傾注了培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿才能叫做平板呢？并且在段首的“待瓊脂凝固后”之前加了“水平放置”作為狀語進行修飾，強調(diào)了操作細節(jié)。

      2、原來的6.2.2合并到了6.2.1的段末。

      3、原6.2.2改為：“如果使用菌落總數(shù)測試片，應(yīng)按照測試片所提供的相關(guān)技術(shù)規(guī)程操作”。這里所謂的技術(shù)規(guī)程，應(yīng)該就是指的其使用說明書，市場上的測試紙片品牌較多，種類也較多，具體操作細節(jié)可能存在一定的差異性，實驗室應(yīng)仔細閱讀說明書，建立作業(yè)指導(dǎo)書，對操作人員進行培訓(xùn)和考核。

      4、水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度和時間仍然保持不變，但在工作實踐中，檢驗員往往會對“水產(chǎn)品”指代的范圍產(chǎn)生困惑，新版標(biāo)準(zhǔn)能夠給與一個明確的定義和舉例就更好了。

（三）菌落計數(shù)

      6.3.2中刪掉了段末的“每個稀釋度的菌落總數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)”，應(yīng)該是避免與后面7.1.2中的公式應(yīng)用產(chǎn)生歧義。

結(jié)果與報告

（一）菌落總數(shù)的計算方法：詳細規(guī)定了6種情形的菌落計算方法，并且還在附錄B中逐一提供了相應(yīng)的案例，便于讀者理解。

（二）菌落總數(shù)的報告：刪掉了老版的“7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延”，這是因為前文6.3.2已經(jīng)明確要選擇“無蔓延菌落生長”的平板，故實際上已經(jīng)明確蔓延菌落為不適合計數(shù)的情況，所以這句話是多余的。

主要參考文獻

[1]國家認監(jiān)委辦公室關(guān)于公布2015年檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審結(jié)論的通知
[2]微信公眾號：六扇門study——GB4789.2修訂一大亮點：增加測試片方法的并行準(zhǔn)入

文章來源：網(wǎng)友Milonese原創(chuàng)分享，環(huán)凱小編轉(zhuǎn)載于食品微生物檢測公眾號！  
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