近年來(lái)，隨著食源性疾病的暴發(fā)，食源性致病菌成為影響食品質(zhì)量與安全的首要因素，食品從原材料生產(chǎn)到最終消費(fèi)都可能通過(guò)與水、空氣、土壤、肥料及食品加工環(huán)境的接觸而被病原體污染。

因此，為了確保食品安全，在將食品投放市場(chǎng)之前，使用可靠、有效的方法檢測(cè)病原菌至關(guān)重要。簡(jiǎn)便、特異、靈敏、低耗且適用的快速診斷及檢測(cè)食品中致病微生物的方法被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)獲得了很大的進(jìn)展，長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的王丹丹、吳淑清*和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院的吳亞君*等人就目前常用微生物快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用和研究現(xiàn)狀作總結(jié)概述，以期對(duì)我國(guó)食品快速檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展提供參考。

01 食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的分類(lèi)

顯色培養(yǎng)基技術(shù)

定位顯色培養(yǎng)基是一種基于生化反應(yīng)的微生物鑒定技術(shù)，其原理是根據(jù)不同微生物胞內(nèi)酶反應(yīng)條件的差異作為分類(lèi)鑒定的依據(jù)，在分離培養(yǎng)基中加入特定的底物，這些底物由微生物可代謝的物質(zhì)及發(fā)色基團(tuán)組成，在微生物特異性酶的作用下，發(fā)色基團(tuán)游離并顯色，通過(guò)觀察菌落的顏色就能夠?qū)N進(jìn)行鑒別。

ATP發(fā)光法

ATP發(fā)光法是一種快速且便捷的操作技術(shù)，只需要幾分鐘便可以得到檢測(cè)結(jié)果。ATP在細(xì)胞代謝中起重要作用，其含量可以直接代表活細(xì)胞數(shù)，原理是將細(xì)菌中的ATP提取出來(lái)，和熒光素酶、氧氣、鎂一同和蟲(chóng)熒光素發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生的熒光推測(cè)計(jì)算其ATP的含量，從而得到所測(cè)樣品中細(xì)菌的含量。目前，ATP發(fā)光技術(shù)在大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等致病菌的檢測(cè)中得到了應(yīng)用。

免疫學(xué)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)是用酶標(biāo)記表面吸附抗原或抗體的固相載體，其與相應(yīng)的抗體或者抗原相結(jié)合，形成帶有酶標(biāo)記的復(fù)合物，得到的攜帶酶的復(fù)合物可與特定底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，通過(guò)對(duì)該產(chǎn)物的定量分析，從而達(dá)到檢測(cè)目的，抗體是確定ELISA靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記已知抗原或抗體，與特異抗體或者抗原結(jié)合后產(chǎn)生熒光的原理實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)致病菌的目的。Ozeh等將免疫熒光技術(shù)與光電動(dòng)力學(xué)技術(shù)相結(jié)合用于水中大腸桿菌的檢測(cè)和定量，并在4 h內(nèi)檢測(cè)限達(dá)到104 CFU/mL。較傳統(tǒng)ELISA而言，該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間更短，靈敏度更高。但該技術(shù)判定結(jié)果的操作過(guò)程較繁瑣，且需要專(zhuān)業(yè)人員操作，因此在食源性病原菌檢測(cè)方面應(yīng)用較少。

膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）是以膠體金作為標(biāo)記物檢測(cè)特定抗原或抗體的免疫標(biāo)記技術(shù)，其以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，待測(cè)物受體與樣品反應(yīng)，產(chǎn)物被聚集到層析材料的某一位置，通過(guò)膠體金可直接觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)中實(shí)時(shí)熒光PCR和多重PCR技術(shù)在快速檢測(cè)中的應(yīng)用比較廣泛，其中實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，在反應(yīng)過(guò)程中隨著熒光信號(hào)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量分析樣品中的待測(cè)成分。相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)對(duì)待檢成分進(jìn)行定性、定量分析，省去電泳步驟，節(jié)省了時(shí)間。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶、60～65 ℃恒溫條件下在體外擴(kuò)增核酸的技術(shù)。王瑾根據(jù)沙門(mén)氏菌invA基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了沙門(mén)氏菌LAMP檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)僅需45 min，靈敏度達(dá)到6 CFU/mL。LAMP技術(shù)也被運(yùn)用到創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)。

2）重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)：重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是另一種新穎的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，由特定的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶結(jié)合，在常溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，5～20 min即可獲得與LAMP一樣的檢測(cè)結(jié)果。

3）滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)：滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)是DNA分子以滾環(huán)式復(fù)制的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其關(guān)鍵在于構(gòu)建一個(gè)完整的單鏈DNA環(huán)用于后續(xù)擴(kuò)增，RCA主要有線(xiàn)性RCA、超分支RCA和多引物RCA。Hao Liling等設(shè)計(jì)了金黃色葡萄球菌的RCA反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生的單鏈DNA用于捕獲反應(yīng)中形成的游離復(fù)合物，從而較少量的復(fù)合物吸附在納米材料上，保持原有化學(xué)發(fā)光，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，結(jié)果表明在最優(yōu)條件下該方法對(duì)純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限可達(dá)15 CFU/mL。

基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)（DNA chip）又稱(chēng)DNA芯片、DNA微陣列技術(shù)，其主要利用核酸分子雜交，是通過(guò)基因芯片上固定的已知序列的核酸或核酸片段去確定被檢測(cè)的DNA樣品，因其通量高、自動(dòng)化程度高等被廣泛應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域。

微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)（microfluidic chip）又稱(chēng)為芯片實(shí)驗(yàn)室，結(jié)合分析化學(xué)、微機(jī)電加工技術(shù)、微管道網(wǎng)絡(luò)、生命科學(xué)等多個(gè)技術(shù)，其將樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等多個(gè)步驟集成到一張芯片上，較基因芯片大多只能使用一次而言，微流控芯片能夠多次使用，因此更有發(fā)展前景。其通常借助光學(xué)方法或熒光信號(hào)檢測(cè)將擴(kuò)增的DNA可視化。

高通量測(cè)序技術(shù)

二代測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)全基因組的研究，把DNA測(cè)序引入到高通量測(cè)序時(shí)代，但是二代測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)過(guò)短、易引入PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤且具有堿基GC偏好性，因此三代測(cè)序應(yīng)用而生，與二代測(cè)序的邊合成邊測(cè)序相比，三代測(cè)序不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免PCR擴(kuò)增引入錯(cuò)誤，同時(shí)第三代測(cè)序具有更高的通量和測(cè)序效率。

生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是由生物感受器和換能器兩大部分組成的分析裝置，檢測(cè)微生物時(shí)主要利用抗原（抗體）以及各種敏感酶、生物堿和基因序列等，若待測(cè)樣品與以上物質(zhì)反應(yīng)，便會(huì)產(chǎn)生生物相互作用，隨后信號(hào)轉(zhuǎn)換器可將其轉(zhuǎn)化為一些可測(cè)量的電信號(hào)，再由信號(hào)放大器進(jìn)行讀取檢測(cè)。通常用于快速檢測(cè)食源性病原體的生物傳感器有光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器以及機(jī)械生物傳感器。

流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）是基于細(xì)胞直接計(jì)數(shù)的一種微生物快速檢測(cè)方法，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置一般包括液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。其使用激光對(duì)通過(guò)激光束的顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定量觀察和定性分析，當(dāng)顆?；蛘呒?xì)胞通過(guò)激光束的時(shí)候，會(huì)對(duì)光線(xiàn)產(chǎn)生折射和反射，此信號(hào)被探測(cè)器記錄下來(lái)，每通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)峰值，最后根據(jù)峰值的個(gè)數(shù)得到細(xì)胞的數(shù)值。FCM對(duì)食品中的活菌數(shù)直接進(jìn)行檢測(cè)，速度快，無(wú)需增菌，可在90～100 min內(nèi)出具檢測(cè)結(jié)果；靈敏度高，甚至可檢測(cè)出1 個(gè)活的微生物或活細(xì)胞；該檢測(cè)技術(shù)適用于水、液態(tài)加工食品、飲料、化妝品及藥品等行業(yè)。

光譜技術(shù)

隨著光學(xué)儀器、光學(xué)技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，光譜檢測(cè)技術(shù)得以快速發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、傅里葉變換紅外光譜技術(shù)被廣泛用于微生物的快速檢測(cè)。拉曼光譜技術(shù)是通過(guò)測(cè)定代謝分子反應(yīng)物質(zhì)分子內(nèi)部化學(xué)鍵的情況，從而確定微生物的種類(lèi)。

質(zhì)譜鑒定技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是一種根據(jù)離子產(chǎn)生的質(zhì)量圖譜來(lái)確定樣品中分子組成的分析技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)不僅可以對(duì)傳統(tǒng)的目標(biāo)分析物進(jìn)行定性和定量分析，還可以用于細(xì)菌的快速準(zhǔn)確鑒定。在微生物的分析中，通過(guò)單個(gè)質(zhì)量峰對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，從而實(shí)現(xiàn)微生物鑒定的快速性和有效性，其檢測(cè)過(guò)程高度自動(dòng)化，極大加強(qiáng)了其簡(jiǎn)便性與應(yīng)用廣泛性。微生物檢測(cè)常用的質(zhì)譜技術(shù)主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）及電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）等。

02 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)出許多檢測(cè)食源性病原體的方法，以解決食品安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題，特別是隨著對(duì)新鮮食品和短保質(zhì)期食品的食用不斷增加，快速檢測(cè)技術(shù)更具市場(chǎng)，眾多學(xué)者在不同快速檢測(cè)技術(shù)上都不斷革新，在檢測(cè)時(shí)間、靈敏度以及準(zhǔn)確度上都有了很大的提升，但也還存在著不足，需要國(guó)內(nèi)外研究者不斷地完善和改進(jìn)現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)。

一方面，幾乎所有的快速檢測(cè)技術(shù)都存在靈敏度不足的缺點(diǎn)，因此還需富集、培養(yǎng)等過(guò)程才可以得到檢測(cè)結(jié)果，免疫磁分離技術(shù)是一種經(jīng)常被用在前處理過(guò)程中以提高檢測(cè)靈敏度的技術(shù)，其已成功用于富集和分離多種病原體，可以有效消除樣品基質(zhì)中的聚合酶抑制劑，從而在檢測(cè)致病菌時(shí)縮短了富集時(shí)間并提高了靈敏度?？焖贆z測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向應(yīng)符合食品安全檢測(cè)的要求，實(shí)現(xiàn)高精度、高效率、低成本方式在線(xiàn)監(jiān)測(cè)病原體。

另一方面，人工智能、基因編輯、納米技術(shù)等前沿學(xué)科融入到食源性致病菌的快速檢測(cè)，也將成為未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)，在檢測(cè)過(guò)程中，還可以根據(jù)檢測(cè)要求選擇適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，并且可以嘗試將未來(lái)多學(xué)科交叉結(jié)合使用，發(fā)揮各學(xué)科的優(yōu)勢(shì)，并實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而提高檢測(cè)的靈敏度、增加檢測(cè)準(zhǔn)確性、縮短檢測(cè)時(shí)間。

另外，國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)幾乎沒(méi)有針對(duì)食源性致病菌快速檢測(cè)的方法，無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)和監(jiān)管的需求，因此還亟待制定一系列快速檢測(cè)技術(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)等，彌補(bǔ)快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏的現(xiàn)狀。

本文《食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展》來(lái)源于《食品科學(xué)》2022年43卷3期276-285頁(yè)，作者：王丹丹，劉鳴暢，楊艷歌，王洪越，袁飛，吳亞君，吳淑清。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201105-048。

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