一種實(shí)現(xiàn)魚類過(guò)敏原快速檢測(cè)的直接快速qPCR
發(fā)布時(shí)間：2024-09-02 瀏覽次數(shù)：74
識(shí)別肉類和食品中的動(dòng)物物種對(duì)于維持食品安全和質(zhì)量非常重要，特別是對(duì)于沒(méi)有或不正確標(biāo)記的動(dòng)物物種，可能導(dǎo)致食物過(guò)敏反應(yīng)，甚至危及生命。嚴(yán)格避免含有過(guò)敏原的食物是最有效的方法。
食品中魚類過(guò)敏原的快速檢測(cè)對(duì)食品安全至關(guān)重要，為了確保食品中魚源成分的真實(shí)性，人們開發(fā)了多種檢測(cè)魚類的方法，包括顯微鏡觀察、免疫學(xué)方法、紅外光譜和色譜分析。鏡觀察有一個(gè)低檢測(cè)限，并取決于檢查員的經(jīng)驗(yàn)和肉組織的完整性。疫方法靈敏、簡(jiǎn)便，但在食品加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)很容易被破壞，從而影響檢測(cè)。紅外光譜技術(shù)對(duì)不同的食物種類需要不同的模型，需要大量的工作，且有一定的局限性。色譜分析根據(jù)產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的種類來(lái)源，可以檢測(cè)到不同的種類，由于產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣，干擾因素多，色譜分析靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。與其他檢測(cè)技術(shù)相比，基于DNA檢測(cè)的PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、不受食品種類限制等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品中物種檢測(cè)的主流技術(shù)。然而之前的檢測(cè)方法存在一些挑戰(zhàn)，如樣品提取繁瑣、耗時(shí)。鑒于現(xiàn)有方法的局限性，作者提出了一種新的直接快速qPCR技術(shù)，以便快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的魚類過(guò)敏原。
本文作者對(duì)魚類物種及其對(duì)應(yīng)的Genbank編號(hào)進(jìn)行分析?；谡婧?8S rDNA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針。使用NCBI BLAST工具評(píng)估引物和探針序列的特異性。優(yōu)化qPCR條件，建立反應(yīng)體系。分析來(lái)自不同物種樣本的特異性和添加不同濃度魚類到其他肉類混合物的敏感性。在真實(shí)食品樣本中進(jìn)行精密度測(cè)試。采用優(yōu)化的核酸釋放劑提取新鮮魚、蝦、牛肉、蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞和鴨的總DNA，并進(jìn)行快速定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有魚類樣品呈現(xiàn)典型的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，而其他動(dòng)物源性物種和空白對(duì)照(ddH2O)均為陰性(圖1)，說(shuō)明直接快速qPCR對(duì)魚類具有特異性，不會(huì)與其他被測(cè)動(dòng)物物種發(fā)生交叉反應(yīng)。
確定快速qPCR條件，包括使用10μL的多探針qPCR混合物、特定濃度的引物和探針、模板DNA和循環(huán)的反應(yīng)程序。通過(guò)不同比例添加魚類到肉類混合物來(lái)評(píng)估敏感性。分析含魚的實(shí)際食品樣本進(jìn)行精密度測(cè)試。通過(guò)與傳統(tǒng)核酸提取方法相比較，驗(yàn)證肉類DNA提取的核酸釋放劑的有效性。
優(yōu)化的直接快速qPCR條件包括62℃的退火溫度和0.25μM的探針濃度。直接快速qPCR具有檢測(cè)0.00001%魚類成分的高精確度。在真實(shí)食品樣本中，中度陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣本的直接快速qPCR方法展示了低于2%的CV值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示直接快速qPCR方法對(duì)于檢測(cè)食品樣本中的魚類成分具有高精確度，所有含有魚的商業(yè)樣本均呈陽(yáng)性。
本實(shí)驗(yàn)在qPCR中采用了UNG酶抗污染方案，從根本上消除了PCR擴(kuò)增子導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在操作步驟和報(bào)告等待時(shí)間方面，本研究與先前報(bào)道的魚源成分qPCR檢測(cè)技術(shù)相比具有顯著優(yōu)勢(shì)(圖2)。作為一種新型的快速現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)方法，在食品中魚類過(guò)敏原的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1
直接快速qPCR檢測(cè)特異性。藍(lán)色s型擴(kuò)增曲線為魚的檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)色直線為蝦、牛肉、螃蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞、鴨及陰性對(duì)照的陰性結(jié)果。黃色s型曲線為內(nèi)參基因的擴(kuò)增結(jié)果。
圖2直接快速qPCR的靈敏度。
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~魏文杰
