產(chǎn)品名稱：腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
英文名稱：Multiplex PCR Detection Kit for Enteropathogenic E. coli (Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 規(guī)格 |
| FZ020BF2 | 48 測試/盒 |
產(chǎn)品簡介：本試劑盒僅用于食品樣本中腸道致病性大腸埃希氏菌 EPEC 的定性檢測。
檢測原理：基于 Real Time PCR 技術(shù)，根據(jù)《GB4789.6-2016》中 EPEC、STEC/EHEC 的判別依據(jù)，針對檢測所需的腸桿菌科的 16S rRNA 基因和毒力基因 escV、bfpB、stx1 與 stx2設(shè)計的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)優(yōu)化配置所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被 Taq 酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量 PCR 儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實時擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC的類型。
escV、stx1&stx2、bfpB、16S rRNA 基因分別對應(yīng)熒光報告基團(tuán) FAM、VIC、Cy5、ROX。
腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分：
儲存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲存，有效期為 12 個月，避免反復(fù)凍融。
靈敏度：單通道最低檢驗限達(dá)到 100 CFU/Test
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測 FAM、VIC、Cy5、ROX 標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：
1，樣品前處理
1) 參照 GB 《4789.6?2016》，使用 1μL 接種環(huán)刮取新鮮培養(yǎng)的待鑒定的可疑菌落到含 30 μL 裂解液的無菌離心管中，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min；
2) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為粗提的 DNA，可轉(zhuǎn)移至 0.2 mL 無菌離心管中，在-20℃下可長期保存。也可以選擇商業(yè)化的細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取。
2, 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取 n 個 PCR 反應(yīng)管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1 管陽性對照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 20 μL 預(yù)混液，待用。
2) 向上述 n 個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽性對照各 5 μL，總反應(yīng)體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 檢測通道，在反應(yīng)階段 2 中60℃時收集熒光信號，具體程序如下：
| 反應(yīng)階段 | 溫度 | 時間 | 信號收集 | 循環(huán)數(shù) |
| 1 | 95°C | 30 sec | 1 | |
| 2 | 95°C | 5 sec | } 40 | |
| 60°C | 40 sec | ? |
3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對照未出現(xiàn)明顯的 S 型擴(kuò)增曲線或Ct 值＞37，陽性對照出現(xiàn) S 型擴(kuò)增曲線且其 Ct 值＜30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得 Ct 值判讀，具體見下表：）
| Ct值 | 判讀結(jié)果 |
| ≤35 | 對應(yīng)的基因陽性。 |
| 35~37 | 建議重新檢測，若復(fù)測結(jié)果 Ct≥37，則對應(yīng)的基因陰性，反之為陽性。 |
| ≥37 | 對應(yīng)的基因陰性。 |
? stx1 和 stx2 基因共用一個通道，可能出現(xiàn)弱陽性現(xiàn)象。
? 陰性對照反應(yīng) 16S rRNA 基因可能會出現(xiàn)弱陽性現(xiàn)象。
? 多重 qPCR 檢測可能出現(xiàn)不同熒光通道之間競爭抑制的問題，單基因分析時適當(dāng)調(diào)整閾值線。
